جداسازی و همسانه سازی توالی های جانبی احاطه کننده(insl وinsr )کلروپلاست اسفناج جهت ساختن وکتور کلروپلاستی

از زمان انجام انتقال ژنتیکی به کلروپلاست طی دو دهه گذشته این روش، به علت مزایای آن، یک جایگاه قابل توجه دربین محققین پیدا نموده است. مزایایی چون : سطوح بالای پروتئین، سهولت بیان پروتئین های چندگانه از mrna های پلی سیسترونی، محدود نگه داشتن ژن از طریق عدم امکان انتقال توسط دانه گرده(وراثت مادری)، فقدان خاموشی ژن، فقدان اثرات مکانی و پلیوتروپیک و فقدان dna خارجی ناخواسته. اولین گام برای ترانسفورماسیون کلروپلاستی، طراحی و ساخت وکتورهای ویژه آن می باشد. وکتورهای کلروپلاستی نسبت به وکتورهای معمولی دارای ساختار متفاوتی هستند. یکی از اجزاء اساسی این وکتورها، وجود توالی های جانبی احاطه کننده چپ و راست برگرفته از ژنوم کلروپلاستی (پلاستوم) گیاه مورد نظر است. در این پژوهش، هدف جداسازی و همسانه سازی این توالی ها از ژنوم کلروپلاستی گیاه اسفناج به منظور ساخت وکتور کلروپلاستی برای آن می باشد. بنابراین توالی کامل ژنوم کلروپلاستی این گیاه از پایگاه داده ncbi تهیه گردید و با بررسی آن، این دو سایت ورود انتخاب و پرایمرهای اختصاصی آن طراحی شد. این توالی توسط pcr تکثیر و در وکتور پایه puc19 با استفاده از سایت برشی pvuii با انتهای صاف کلون گردید. سازه بدست آمده (pucins) با روش شوک حرارتی به باکتری اشریشیاکلی سویه dh5? منتقل شده و باکتری های تراریخته بر روی محیط حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین 75 میلی گرم درلیتر، انتخاب شدند. با استفاده از تکنیک های مختلف colony pcr، هضم آنزیمی، توالی یابی و هم ردیف سازی آن در بانک اطلاعاتی حضور این توالی در ناقل تایید شد. جزء مهم دیگر در این وکتورها، ژن نشانگر انتخابی مقاومت به آنتی بیوتیک می باشد. بنابراین پرایمرهای اختصاصی جهت تکثیر ژن aada که باعث ایجاد مقاومت به آنتی بیوتیک های اسپکتینومایسین و استرپتومایسین می شود به همراه پروموتور و ترمیناتور ویژه کلروپلاستی از وکتور pkcz طراحی گردید. این قطعه نیز بعد از تکثیر در سازه pucins با استفاده از سایت برشی pvuii با انتهای صاف کلون شد. سازه ساخته شده با نام pucinsaada به باکتری اشریشیاکلی سویه dh5? منتقل شده و باکتری های تراریخته بر روی محیط حاوی آنتی بیوتیک استرپتومایسین رشد کرد. این موضوع نشان می دهد که ژن aada تحت پروموتر و ترمیناتور کلروپلاستی در باکتری اشریشیاکلی بیان می شود که تائیدی بر نظریه درون همزیستی نیز می باشد. قابل ذکر است که تاکنون گزارشی از ساخت وکتور کلروپلاستی برای گیاه اسفناج منتشر نشده است و می توان تحقیق حاضر را اولین گزارش در این زمینه دانست.